Отдельный нейрон, окрашенный

Однако если изменения появятся в нервных окончаниях с пресинаптической стороны, то для их количественной оценки понадобятся методы электронной микроскопии, поскольку световой микроскоп не дает достаточного увеличения.

Такие количественные морфологические наблюдения, т. е. определение формы, числа и величины клеток в мозгу, даже сегодня, при наличии компьютерных систем и весьма совершенных способов анализа изображений, требуют больших затрат времени и, если наблюдатель недостаточно внимателен, таят в себе опасность неверного истолкования. Какую долю клеток из сотен тысяч, имеющихся в каждом крошечном участке мозга, нужно исследовать, чтобы получить репрезентативную картину?

Как можно быть уверенным, что наблюдаемые под микроскопом изменения "действительно" происходят в живом мозгу, а не являются артефактом искусственно вызванным результатом применения того или иного метода фиксации, приготовления срезов или окрашивания мозговой ткани с целью сделать видимым ее строение? Как можно перенести результаты измерений на двумерных срезах на трехмерную живую ткань? Все эти технические вопросы встали передо мной и моим коллегой Майком Стюартом в начале нашей работы на цыплятах, когда стало ясно, что нам понадобятся измерения такого рода. Майк настолько увлекся этой задачей, что создал действительно первоклассную лабораторию количественной морфологии.

Но что именно следовало измерять у цыплят, учитывая множество открывающихся возможностей?
В конце XIX века миланский анатом Камилло Гольджи почти что неожиданно для себя открыл краситель на основе солей серебра, который окрашивал в срезах очень небольшую (по-видимому, случайную) выборку нейронов, настолько четко выделяя отдельные клетки, что видны были и мельчайшие детали клеточного тела, и дендриты, и даже мириады крошечных шипиков, усеивавших поверхность дендритов. Любопытно, что сам Гольджи, получивший Нобелевскую премию (отчасти и за эту работу), не верил в существование в мозгу отдельных нейронов, представляя себе его ткань как непрерывную сеть волокон. Он упорствовал в этом заблуждении вопреки всем данным, которые доставляла его же собственная методика окрашивания. Значение открытия Гольджи было оценено лишь знаменитым нейроанатомом из Мадрида Раман-и-Кахалом, который тоже стал Нобелевским лауреатом (хотя Гольджи отказывался не только принять его доводы, но даже разговаривать с ним). Каждого, кто видит препараты нейронов, окрашенных по Гольджи, восхищают сложность и изящество их ветвления.

Даже сейчас, через десятки лет после того, как я впервые увидел такие препараты, они кажутся мне необычайно красивыми, и я погружаюсь в созерцание клеточной чащи, которая выглядит тем более таинственной, что окраска придает препарату какую-то осязаемость, почти трехмерность. Она делает видимыми лишь некоторые из множества нейронов, так что клетки выступают на общем фоне как облетевшие деревья в тумане ( 10.6).
Но одно дело восхищаться красотой таких изображений и

10.6. Нейроны IMHV. А. Отдельный нейрон, окрашенный по Гольджи.

Б. Дендрит при большем увеличении с шипиками на его поверхности.
совсем другое давать их структуре количественную оценку. Что нужно измерить, чтобы отличить нейрон, изменившийся после обучения? Поверхность всех дендритов, отходящих от тела клетки, покрыта синапсами, возможно, числом до десятка тысяч, которые принадлежат другим нейронам и обеспечивают связь между клетками. Одни синапсы размещаются прямо на самих дендритах, другие на крошечных шипиках, отходящих от их поверхности (они видны на 10.6).

Перестройка синаптических связей между нейронами в соответствии с гипотезой Хебба может быть связана с изменением длины дендритов, характера их ветвления или количества шипиков.
Насколько сильно каждый из синапсов будет воздействовать на постсинаптическую клетку, зависит от разных факторов: от близости синапса к телу нейрона, от локализации его на стволе дендрита или многочисленных шипиках и т. д. В синапсе медиатор, выделяемый на пресинаптической стороне, связывается с постсинаптическим рецептором, что приводит к изменению электрических свойств постсинаптической мембраны и возбуждению вокруг нее слабого электрического тока. Действие этого тока на остальную часть дендрита, а потом и на тело клетки в большой степени определяется геометрией участка, окружающего синапс. Расчеты биофизиков показали, что от синапсов, расположенных на шипиках, электрическая реакция распространяется эффективнее, чем от синапсов на самих дендритах, а ток в отдельных шипиках зависит от их формы. Поэтому любое изменение в структуре дендритов или в расположении на них синапсов может изменять нейрофизио-

логические взаимодействия между пре- и постсинаптическими клетками. Иначе говоря, характер межнейронных связей может изменяться не только при увеличении или уменьшении каждого отдельного синапса (например, синапс может переместиться со ствола дендрита на шипик).
Есть веские основания полагать, что форма и характер ветвления дендритов тоже имеют важное значение и могут изменяться под воздействием обучения или других форм приобретения опыта. Приготовление микроскопических препаратов неизбежно связано с фиксацией и окраской ткани, поэтому то, что мы видим, всегда выглядит как очень жесткая структура. Но в живом организме сеть дендритов подвижна, как ветки деревца при легком ветре [13], и нетрудно предвидеть, что их взаимное расположение будет меняться.

Однако анализировать эти изменения не так-то просто. Гораздо проще подсчитывать число дендритных шипиков, и именно этим занимался в середине 80-х годов Санджай Пател, один из диссертантов, работавший в лаборатории Майка Стюарта. Он обучал цыплят и спустя сутки приготовлял препараты правого и левого IMHN, окрашенные по методу Гольджи.

После этого он отбирал нейроны определенного типа с длинными аксонами, измерял длину каждой ветви дендрита и подсчитывал на ней шипики, а затем вычислял количество последних на один микрометр (одну миллионную долю метра) длины дендрита.
К нашей общей радости (и, должен сказать, к моему удивлению), результаты подсчета оказались весьма впечатляющими. Через 24 часа после обучения число шипиков на дендритах в левом IMHV увеличивалось на 60% (но практически не изменялось в правом IMHV). Форма шипиков тоже несколько менялась: создавалось впечатление, что кончик у каждого из них раздувался, словно маленький воздушный шарик.

Именно это и должно было происходить, согласно биофизической теории, в случае усиления электрической связи между пре- и постсинаптическими областями системы у цыплят, клевавших горькую бусину. К точно такому же изменению должен был приводить повышенный биосинтез гликопротеинов [14].
Итак, мы получили четкие данные о весьма значительном изменении постсинаптических структур в процессе приобретения опыта. Но в арсенале морфологических методов Майка Стюарта была не только световая, но и электронная микроскопия. При том увеличении электронного микроскопа, которое

10.7. Синапс в IMHV. Отдельный синапс с пузырьками. Звездочкой отмечен синаптический контакт с головкой дендритного типика Широкими стрелками показано утолщение постсинаптической мембраны. (Фото любезно предоставил Майк Стюарт.)
мы обычно используем, ноготь большого пальца имел бы 250 метров в ширину, а упорядоченная картина, выявляемая при окраске по Гольджи, обращается в хаос, истолковать который может только очень дисциплинированное воображение. Электронная микроскопия не позволяет просто увеличить окрашенное изображение и от начала до конца рассмотреть каждую отдельную клетку и все ее связи; изменения шипиков, видимые в обычный микроскоп, трудно отнести к определенным синапсам, выявляемым с помощью электронной микроскопии. Впрочем, опыт и верный глаз помогают разобраться в хаосе электронно-микроскопической картины и различить отдельные синапсы, клеточные тела, аксоны и дендриты, чтобы измерить их.

На 10.7 показана электронная микрофотография синапса из IMHV с обозначениями, которые помогут понять, что на ней видно. Если говорить точно, то синапс это то место, где пресинаптическое окончание тесно сближено с постсинаптической мембраной. На фото это место имеет вид утолщенной темной полоски, где мембраны двух клеток практически (хотя
и не совсем) соприкасаются. Это утолщение представляет собой тот участок постсинаптической мембраны, где имеются рецеп-торные молекулы, связывающие нейромедиатор после его высвобождения из мелких пузырьков, плотно упакованных в пресинаптическом окончании. В качестве параметров, заслуживающих измерения, сами собой напрашиваются число таких окончаний в данном объеме ткани, их средняя величина (объем) и длина синаптического утолщения.

Запасшись временем и терпением (если вы собираете материал для диссертации или просто горите энтузиазмом), можно даже подсчитать число пузырьков в каждом окончании.
Майк, работавшие у него выпускники университета и приезжие стажеры определяли все эти параметры в синапсах IMHV и LPO. В начале наших исследований это делали через сутки после обучения цыплят, исходя их того, что для любого структурного изменения нужно время.

Содержание раздела